Estudio estructural y funcional de la unión de nucleótidos en la Na+, K+- ATPasa

Abstract

El intercambio activo de Na+ (3 iones hacia el interior celular) y K+ (2 iones al exterior) se lleva a cabo por la enzima transmembrana Na+, K+- ATPasa (~110 KDa). La subunidad catalítica α de esta proteína hace partícipes a sus dominios citoplásmicos (dominio de transporte o TM y los dominios citoplasmáticos A, N y P), para coordinarse en una serie de pasos consecutivos que logran hidrólisis del sustrato, una molécula de trifosfato de adenosina (ATP, del inglés adenosine triphosphate). Específicamente, la unión del ATP es un paso esencial en el ciclo catalítico que comienza con el reconocimiento y la interacción de la molécula de ATP en el dominio de unión a nucleótidos (dominio N). El objetivo de este trabajo es generar nueva información sobre el paso de unión al sustrato en la Na+, K+- ATPasa, enfocando el estudio en el efecto de los cationes Na+, K+ y Ca2+ sobre la unión de ATP, utilizando un dominio N heterólogo purificado (~28 KDa).

El dominio N de la subunidad α1 porcina se expresó de forma soluble y se purificó exitosamente a partir del sistema de expresión en Escherichia coli BL21(DE3). Estudios in silico permitieron encontrar los modos de unión estable para tanto ATP como para el marcador fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC, del inglés fluorescein isothiocyanate), y permitieron la identificación de residuos significativos en la interacción dominio N y el sustrato.

Posteriormente, la capacidad de unir ligandos se confirmó para el dominio N mediante un ensayo de competencia con FITC, en el que se observó una disminución significativa de la señal fluorescente de la proteína marcada en presencia de ATP (1, 2, 3 y 4 mM), NaCl (10, 50 y 150 mM), KCl (10, 50 y 150 mM), y CaCl2 (200 nM).

Mediante la extinción de fluorescencia del dominio N por acrilamida, se mostró la utilidad de los dos residuos de triptófano (W390 y W416) para estudios estructurales de cambio de fluorescencia. La fluorescencia intrínseca del dominio N disminuyó en presencia de ATP y/o cationes (Na+, K+ y Ca2+), mostrando que en presencia de cationes se incrementa la afinidad del dominio N por el ATP. Además, fue posible determinar la afinidad del ATP en cada situación estudiada.